TP SVT : Recherche du glucose et du glycogène hépatiques

En 1855, Claude Bernard (St Julien 1813 - Paris 1878), médecin, physiologiste et épistémologue français, réalise une expérience demeurée célèbre qu'il décrit dans ses Comptes rendus de l’Académie des Sciences : « J'ai choisi un chien adulte, vigoureux et bien portant qui depuis plusieurs jours, était nourri de viande ; je le sacrifiai 7 heures après un repas copieux de tripes. Aussitôt, le foie fut enlevé, et cet organe fut soumis à un lavage continu par la veine porte... Je laissai ce foie soumis à ce lavage continu pendant 40 minutes ; j'avais constaté au début de l'expérience que l'eau colorée en rouge qui jaillissait par les veines hépatiques était sucrée ; je constatai en fin d'expérience que l'eau, parfaitement incolore qui sortait, ne renfermait plus aucune trace de sucre... J'abandonnai dans un vase ce foie à température ambiante et, revenu 24 heures après, je constatai que cet organe que j'avais laissé la veille complètement vide de sucre s'en trouvait pourvu très abondamment ... Cette expérience prouve que dans un foie frais à l'état physiologique, c’est-à-dire en fonction, il y a deux substances : le sucre, très soluble dans l'eau, emporté par lavage ; une autre matière, assez peu soluble dans l'eau; c'est cette dernière substance qui, dans le foie abandonné à lui-même, se changea peu à peu en sucre ». Claude Bernard appella cette substance peu soluble régénérant le sucre la « matière glycogène ».

Le glycogène est la forme de stockage du glucose des animaux et champignons. Cette macromolécule est un polyoside proche de l'amidon, forme de stockage du glucose des végétaux, ce qui lui a valu d'être longtemps qualifié d'amidon animal. Dans la molécule de glycogène et d'amidon des unités glucose reliées par des liaisons osidiques alpha 1-4 forment une chaîne hélicoïdale sur laquelle des chaînes secondaires de même constitution se branchent par des liaisons osidiques alpha 1-6. Dans le glycogène, ces ramifications sont présentes environ tous les dix résidus glucose tandis que dans l'amidon, elles sont présentes environ tous les trente résidus. En présence d'iode, le glycogène se colore en brun acajou alors que l'amidon se colore en bleu-violet. Le glycogène est présent en quantité importante surtout dans le foie (15 à 50 g/kg) et dans les muscles (1 à 10 g/kg). Dans les cellules, le glycogène se trouve dans le cytosol où il forme des granulations de 10 à 40 nm de diamètre souvent regroupées en rosettes.

Protocoles :

• Recherche du glucose hépatique :

• laver soigneusement sous l'eau du robinet un échantillon de foie frais jusqu'à ce que l'eau qui s'écoule soit dépourvue de sang,

• découper l'échantillon en petits morceaux d'environ 5 mm de côté,

• placer les morceaux dans un bécher et les recouvrir d'eau distillée,

• agiter légèrement et réaliser un test du glucose ; pour cela, tremper une bandelette-test glucose dans l'eau du récipient, sortir la bandelette, attendre 10 secondes et lire la bandelette

• laver soigneusement les morceaux de foie sous l'eau du robinet,

• remettre les morceaux de foie dans un bécher, les recouvrir d'eau distillée et effectuer un nouveau test glucose, tant qu'il est positf, refaire le lavage

• laisser alors le foie séjourner dans le bécher ; au bout de 15 min, agiter légèrement et effectuer un nouveau test du glucose.

  • Extraction du glycogène hépatique :

• couper env. 10 g. de foie (congelé si possible) en petits cubes,

• faire bouillir dans l'eau,

• broyer après égouttage puis porter à nouveau à ébullition,

• filtrer et ajouter quelques gouttes d'acide chlorhydrique au filtrat,

• filtrer à nouveau et ajouter de l'alcool jusqu'à obtenir un précipité

• filtrer, récupérer le précipité dans le filtre

• tester la présence de glycogène à l'aide de l'eau iodée dans le filtre (le glycogène donne une coloration brun-acajou en présence d'eau iodée).

  • Observation du glycogène dans les hépatocytes :

• inciser ou couper un petit morceau de foie et gratter avec le scalpel la surface de la section de façon à déposer sur une lame un échantillon de la taille d'une tête d'allumette.

• étaler et dissocier au maximum l'échantillon avec le scalpel pour séparer les cellules.

• recouvrir d'une goutte d’eau iodée. Laisser agir de une à plusieurs minutes.

• déposer une goutte de glycérine (glycérol) et bien mélanger avec la pointe du scalpel. Le glycérol évite l’évaporation du milieu de montage. Si vous ne mettez pas de glycérol, la durée d’observation sera brève.

• poser une lamelle sur l’échantillon.

• utiliser du papier essuie-tout pour presser sur la lamelle en effectuant quelques mouvements latéraux de façon à dissocier les cellules (attention à ne pas casser la lamelle).

• si nécessaire, essuyer la surface de la lamelle.

• observer au microscope à faible grossissement pour rechercher les régions de la préparation où les cellules sont dissociées et suffisamment colorées. Si ce n’est pas le cas, refaire la manipulation.

• le dessin est à faire au grossissement maximal, éventuellement avec l’objectif à immersion.

Références :

http://www2.ac-lyon.fr/enseigne/biologie/ress/alimentation/foi_glu.html

https://ecebac.fr/dl.php?path=Li9zdWpldHMvMjAyMi9TVlQvMjgvRUNFXzIyX1NWVF8yOC5kb2N4

https://biolycee.pagesperso-orange.fr/TSVT-th5-act09.htm

https://exocorriges.com/doc/35447.doc

En 1865, dans son ouvrage Introduction à la médecine expérimentale, Claude Bernard entreprend de résumer et d’illustrer les principes de la méthode expérimentale. Il présente notamment la situation qui l’a amené à l’une de ses plus grandes découvertes alors qu’il travaillait, à partir de foies isolés et lavés, sur la production de glucose chez les animaux : « Je répétais toujours deux dosages de la matière sucrée [glucose] et d’une manière simultanée, avec le même tissu hépatique. Mais un jour il m’arriva, étant pressé par le temps, de ne pouvoir pas faire mes deux analyses au même moment, je fis rapidement le dosage immédiatement après la mort de l’animal, et je renvoyais l’autre au lendemain. Mais je trouvai cette fois des quantités de sucre beaucoup plus grandes que celles que j’avais obtenues la veille pour le même tissu hépatique. »