2/
Séquençage
génomique et bioinformatique
Séquençage et bioinfo en Video INSERM 3’54
: https://youtu.be/TCnG7R50IlU
Le séquençage de l'ADN est inventé dans la
deuxième moitié des années 1970. Deux méthodes sont développées
indépendamment, l'une par l'équipe de Walter Gilbert, aux
États-Unis, et l'autre par celle de Frederick Sanger (en 1977), au
Royaume-Uni. Ces deux méthodes sont fondées sur des principes
diamétralement opposés : l'approche de Sanger est une méthode par
synthèse enzymatique sélective, tandis que celle de Maxam et
Gilbert est une méthode par dégradation chimique sélective.
La méthode de Maxam et Gilbert nécessite des
réactifs chimiques toxiques et reste limitée quant à la taille des
fragments d'ADN qu'elle permet d'analyser (< 250 nucléotides).
Moins facile à robotiser, son usage est devenu aujourd'hui
confidentiel.
Au cours des 25 dernières années, la méthode de
Sanger a été largement développée grâce à plusieurs avancées
technologiques importantes :
la mise au point de vecteurs de séquençage
adaptés, comme le phage
M13 développé par Joachim Messing au début des années 1980 ;
le développement de la synthèse chimique
automatisée des oligonucléotides
qui sont utilisés comme amorces dans la synthèse ;
l'introduction de traceurs fluorescents à la
place des marqueurs radioactifs utilisés initialement. Ce progrès
a permis de sortir le séquençage des pièces confinées
nécessaires à l'usage de radio-isotopes ;
l'adaptation de la technique PCR
pour le séquençage ;
l'utilisation de séquenceurs
automatiques de gènes ;
l'utilisation de l'électrophorèse
capillaire pour la séparation et l'analyse.
Sanger method in video :
https://youtu.be/-QIMkQ4E_wE
La génomique est une discipline de la
biologie
moderne. Elle étudie le fonctionnement d'un organisme, d'un organe,
d'un cancer, etc.
à l'échelle du génome,
au lieu de se limiter à l'échelle d'un seul gène.
La génomique se divise en deux branches :
La bio-informatique, ou bioinformatique,
est un champ de recherche multi-disciplinaire de la biotechnologie
où travaillent de concert biologistes,
chimistes, médecins, informaticiens,
mathématiciens,
physiciens et
bio-informaticiens, dans le but de résoudre un problème
scientifique posé par la biologie.
Plus généralement, la bio-informatique est l'application de la
statistique
et de l'informatique
à la science biologique. Le spécialiste qui travaille à mi-chemin
entre ces sciences et l'informatique est appelé bio-informaticien
ou bionaute. Ce domaine s'étend de l'analyse
du génome à la modélisation
de l'évolution d'une population animale dans un environnement donné,
en passant par la modélisation
moléculaire, l'analyse
d'image, l'assemblage de génome
et la reconstruction d'arbres
phylogénétiques (phylogénie).
Cette discipline constitue la « biologie in
silico », par analogie avec in
vitro ou in
vivo.
Le
développement des techniques de séquençage de l’ADN et les
progrès de la bioinformatique donnent directement accès au génôme
de chaque individu comme à ceux de ses ascendants et descendants.
3/
Maladie
&
thérapie
gén(et)ique
Recenser des
informations sur les nombreux mutants du gène de la mucoviscidose et
les analyses prédictives qui peuvent être conduites.
La mucoviscidose est une des maladies génétiques
potentiellement graves les plus fréquentes en France et dans les
pays occidentaux. Elle touche surtout les fonctions digestives et
respiratoires. Ses symptômes invalidants et les complications
infectieuses et fonctionnelles qui en découlent impactent
l’espérance de vie des patients.
6 000 malades en France en 2020
200 nouveaux-nés chaque année
= 1 /4 500 en moyenne
1 /3 000 en Bretagne
1 /8 000 en Languedoc-Roussillon
Espérance de vie :
5 ans en 1960
40 ans en 2020
L’épais mucus qui encombre les bronches
entraîne en premier lieu l’installation d’une
bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) qui épuise
progressivement les capacités respiratoires du patient, entraînant
à terme une insuffisance respiratoire.
Le mucus présent dans les bronches fait également
le lit d’infections bactériennes fréquentes et spécifiques par
Staphylococcus aureus (staphylocoque doré), Haemophilus influenzae
ou encore Pseudomonas aeruginosa.
Dès 1953 une concentration anormalement élevée
du chlore et du sodium était mesurée dans la sueur.
la protéine CFTR est associée aux canaux
transporteurs d'ions chlore et sodium
Le dysfonctionnement de ces canaux s'explique par
la présence de la protéine CFTR modifiée chez les malades.
L'épithélium respiratoire produit un mucus anormal et les glandes
sudorales une sueur plus salée que la normale
la protéine CFTR (Cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator)
présente dans la membrane des cellules de
différents muqueuses : respiratoire, digestive…
Elle fonctionne comme un canal qui permet
l’échange d’ions chlorures entre l’intérieur et l’extérieur
de la cellule.
Lorsque son gène est muté, le canal
dysfonctionne.
Par le biais de différentes cascades biologiques,
il en résulte notamment une diminution de l’eau excrétée au
niveau des muqueuses et, en conséquence, une inflammation et un
épaississement du mucus qui le recouvre.
L'identification directe du gène et de ses
différentes mutations est possible depuis 1989. Le gène CF (CF pour
Cystic Fibrosis) est un grand gène de 250 kilo-bases qui code pour
une protéine de 1480 acides aminés appelée protéine CFTR.
Le gène CFTR peut être porteur de nombreuses
mutations : près de 2 000 altérations différentes du gène
ont été identifiées. Parmi elles, la mutation Delta F508 est la
plus fréquente : elle est présente chez 70 % des malades sous forme
hétérozygote (une seule copie), et chez 50 % d’entre eux sous
forme homozygote (deux copies).
Mutation de classe 2 : mutations perturbant le
processus de maturation cellulaire de la protéine. De nombreuses
mutations altèrent la maturation de la protéine et son ciblage vers
la membrane plasmique. Ainsi, la protéine est soit absente, soit
présente en quantité réduite dans la membrane apicale. Les
mutations de cette classe représentent la majorité des allèles CF.
L’examen des arbres généalogiques familiaux
permet de connaître les modes de transmission héréditaire des
déterminants génétiques responsables.
Il existe à proximité du gène CF une région
non codante où se trouvent des sites de restriction (coupure
par des enzymes de restriction) reconnus par l'enzyme Taq I.
L'allèle fonctionnel est lié à 4 sites de
restriction tandis que l'allèle morbide est lié à 3 sites de
restriction.
On dispose d'une sonde XV2C radioactive capable de
s'hybrider à ce locus avec les fragments de restriction (chacun
d'eux est exprimé en kilobases (kb).
La technique du Southern-blot permet de révéler
pour chaque individu la présence de tel ou tel fragment de
restriction au locus XV2C et donc d’identifier quel allèle est
présent
La technique du Southern-blot permet de révéler
pour chaque individu la présence de tel ou tel fragment de
restriction au locus XV2C. Principales étapes de cette technique :
1. l’ADN est digéré par l'enzyme de
restriction Taq I.
2. Les fragments de restriction sont séparés par
électrophorèse puis sont mis sous forme simple brin.
3. La sonde radioactive va s'hybrider avec les
fragments qui comportent au moins une partie complémentaire avec
elle.
4. Après lavage, l'autoradiographie révèle les
fragments de restriction qui se sont hybridés avec la sonde
radioactive XV2C pour différents individus de cette famille
La thérapie génique est une stratégie qui
consiste à faire pénétrer des gènes dans les cellules d'un
patient pour traiter une maladie.
Le virus vecteur infecte les cellules épithéliales
bronchiques cibles
Le gène CFTR s’intègre au génome des cellules
bronchiques
Thérapie génique à base d'un vecteur adénovirus
(virothérapie).
Un nouveau gène est inséré dans un vecteur
dérivé d'un adénovirus, lequel est utilisé pour introduire l'ADN
modifié dans une cellule humaine. Si le transfert se déroule
correctement, le nouveau gène élaborera une protéine fonctionnelle
qui pourra alors exprimer son potentiel thérapeutique.
L'éventail des vecteurs est large :
• Les vecteurs intégratifs, comme les
rétrovirus et les lentivirus, permettent d'insérer un gène
thérapeutique dans l'ADN de l'hôte, garantissant ainsi son maintien
dans les cellules filles après divisions.
• Les vecteurs non intégratifs (adénovirus,
AAV) permettent au contraire d'éviter l'intégration aléatoire du
gène dans l'ADN de l'hôte.
• D'autres essais sont tentés avec de l'ADN nu,
directement injecté dans l'organisme.
in vivo : Pour les maladies musculaires,
respiratoires, oculaires, cardiaques ou neurologiques, le transfert
du gène se fait in vivo, par injection du gène vectorisé
directement dans l’organisme ou dans l’organe à traiter, comme
un médicament. De nombreux essais cliniques sont en cours avec cette
technique et plusieurs produits ont atteint le stade de la mise sur
le marché (Glybera, Luxturna).
exvivo : - mieux contrôler les étapes
- utiliser moins de vecteurs
- éviter la dispersion du traitement dans des
organes non ciblés.
Solution plus souvent utilisée pour le traitement
des maladies sanguines, car il est possible de prélever les cellules
à corriger par une simple prise de sang.
Le premier médicament ex vivo (Strimvelis, 2016)
correspond à des cellules hématopoïétiques CD34+ prélevées à
des patients atteints d’un déficit immunitaire sévère
(ADA-DICS).
Utiliser des virus génétiquement modifiés pour
tuer des cellules cancéreuses
Ces virus sont appelés oncolytiques. Ils sont
modifiés génétiquement pour infecter spécifiquement les cellules
tumorales qu’ils détruisent. Un premier virus oncolytique, issu
d’une souche d’herpès, a obtenu une autorisation de mise sur le
marché en 2015 (Imlygic). Il est indiqué dans le traitement du
mélanome
Produire des cellules thérapeutiques par thérapie
génique
Pour certaines pathologies complexes, il n’y a
pas un gène unique à réparer ou à remplacer. Mais il est possible
de concevoir des stratégies indirectes : en associant thérapie
cellulaire et thérapie génique, on peut obtenir des cellules qui
possèdent de nouvelles propriétés thérapeutiques.
Modifier l’ARN pour obtenir une protéine
fonctionnelle
Cette technique consiste à faire produire par la
cellule une version modifiée de la protéine qui lui fait défaut.
Cela nécessite l’injection de petits oligonucléotides (Courts
segments d’acides nucléiques ARN ou ADN) anti-sens qui se fixent
sur l’ARN messager transcrit à partir du gène muté et en
modifient l’épissage, une étape importante avant sa traduction en
protéine.
Dans la maladie de Duchenne, causée par des
mutations dans le gène de la dystrophine, les approches de « saut
d’exon » consistent à faire omettre les séquences du gène qui
portent la mutation. On obtient une dystrophine plus courte que la
protéine normale, mais fonctionnelle.
Dans l’amyotrophie spinale, l’approche est de
bloquer un site inhibiteur d’épissage, afin de « réinclure » un
exon dans l’ARN pour obtenir une forme normale du gène SMN2.
Eliminer ou réparer un gène altéré directement
dans la cellule
Cette technique, appelée édition génomique
permet de réparer des mutations génétiques de façon ciblée. Elle
nécessite d’importer plusieurs outils dans la cellule :
des enzymes spécifiques (nucléases) qui vont
couper le génome là où c’est nécessaire
un segment d’ADN qui sert à la réparation
du génome et permettra de retrouver un gène fonctionnel
Parmi ces outils, on trouve les nucléases à
doigt de zinc, les TALEN et surtout les outils CRISPR. Ces approches
sont encore très expérimentales, mais la révolution apportée par
la simplicité du système CRISPR suscite des espoirs extrêmement
importants. Plusieurs essais cliniques sont déjà en cours aux
Etats-Unis et en Chine.
Génomique : Étude conduite à l’échelle
du génome, portant sur le fonctionnement de l’organisme, d’un
organe, d’une pathologie…
Nucléases : Enzyme capable de couper des
acides nucléiques au niveau des liaisons phosphodiesters.
Les vecteurs, clés du succès de la thérapie ex
vivo et in vivo
Une des difficultés associées au développement
de la thérapie génique est qu’il faut faire pénétrer un acide
nucléique à visée thérapeutique dans les cellules d’un patient.
Les vecteurs viraux :
intégratifs : l’ADN du vecteur viral
s’intègre dans l’ADN de l’hôte => se reporduit avec
celle-ci => modifie le génôme. Ex : vecteurs lentiviraux,
dérivés de virus humains comme le VIH rendus inoffensifs.
non intégratifs : le gène thérapeutique
demeure dans la cellule sans s’intégrer au génome de l’hôte =>
meurt avec la cellule hôte. Ex : vecteurs dérivés de virus
adéno-associés (ou AAV).
Les vecteurs non viraux :
l’injection directe d’ADN, modifié et protégé
des nucléases grâce à des modifications chimiques, ou intégré
dans un plasmide.
La lipofection : le gène thérapeutique est
associé à des lipides cationiques qui favorisent son entrée dans
la cellule hôte.
l’électroporation ou la nucléofection, par
application d’un champ électrique, sont très utilisés, notamment
pour la délivrance des protéines et oligonucléotides du système
CRISPR pour des approches ex vivo,
Video : https://youtu.be/OoAJqxxSRgY
Site dédié : https://www.vaincrelamuco.org/
exercice en ligne :
http://svt.tice.ac-orleans-tours.fr/php5/publis/genetique/mucovisc.htm
schémas :
http://svt.ac-dijon.fr/schemassvt/spip.php?page=recherche&recherche=mucoviscidose#pagination_articles_recherche
Maladie
génétique : un gène est défectueux ≠
gène de susceptibilité
Thérapie
génique : modifier ou remplacer le gène défectueux
